HiFi One-Step RTPCR Mix
描述:
本试剂采用稳定高效的RT-PCR预混体系,是以RNA为模板进行一步法RT-PCR 的专用试剂。其原理为用基因特异性引物进行反转录反应,获得链cDNA(不可使用Oligo(dT或Random Rimer合成链cDNA),再使用基因特异性正向引物和反向引物进行PCR扩增,在同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部过程。反应体系中已含有电泳所需的指试剂(蓝色和黄色),反应后可以直接进行电泳。
在本试剂盒中,将耐热M-MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、Hotstart 高保真 DNA聚合酶以及稳定剂等配制成50×One-Step Enzyme Mix预混液;反应 Buffer、dNTP以及电泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此使得操作更加简单便,扩增产物可用于平端克隆和DNA测序。
主要优势:
耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构,只需10min 即可完成逆转录。
DNA聚合酶为热启动型高保真酶,能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性,酶激活仅需2min。
具有宽泛的模板量兼容性,10ng~1μg都可有效扩增。
反应过程中无需开盖,避免了操作过程中的污染危害。
储存:请置于-20°C,可保存2年;避免反复冻融。
注意:
1. 50×One-Step Enzyme Mix粘度高,次使用之前要离心收集至反应管底部,吸取时应缓慢小心。
2. 由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶,反应配制可在常温进行,但各组分应-20°C保存。
实验操作和反应条件:
1.按以下组分配制反应液注意:
超过1μg的RNA模板量会抑制PCR反应,建议次可使用200ng的RNA模板,然后根据结果进行优化。
2. 在PCR仪上按以下条件进行RT-PCR反应:
3. PCR反应结束后,可取5μl产物直接进行电泳检测。预混液中已经包含绿色染料,无需再加入DNA Loading Buffer。1% Agarose电泳时,蓝色指示剂指示3~5 kb,黄色示剂指示<50 bp。